一、引言

桔青霉素（Citrinin，CIT）是一種由青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）某些菌株產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于小麥、裸麥、大麥、燕麥等農(nóng)作物中。研究表明，桔青霉素對(duì)哺乳動(dòng)物具有腎臟毒性，可造成腎臟、肝臟、腸道和生殖系統(tǒng)的損傷。2017年，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列入3類(lèi)致癌物清單。紅曲霉在產(chǎn)生紅曲色素等有益代謝產(chǎn)物的同時(shí)，部分菌株也會(huì)產(chǎn)生桔青霉素，引發(fā)了人們對(duì)紅曲產(chǎn)品安全性的關(guān)注。

為保障食品安全，我國(guó)于2016年發(fā)布了GB 5009.222-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測(cè)定》-。該標(biāo)準(zhǔn)代替了GB/T 5009.222—2008《紅曲類(lèi)產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定》、SN/T 2426—2010《進(jìn)出口糧谷中桔霉素含量檢測(cè)方法 液相色譜法》和SN/T 2916—2011《出口食品中桔霉素的測(cè)定方法 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》。與舊版標(biāo)準(zhǔn)相比，主要變化包括：標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測(cè)定"、增加了凈化步驟、擴(kuò)大了適用范圍。本文對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)解讀。

二、標(biāo)準(zhǔn)適用范圍

GB 5009.222-2016規(guī)定了食品中桔青霉素的測(cè)定方法，包含兩種方法：

·         第一法（免疫親和柱凈化-高效液相色譜法） ：適用于大米、玉米、辣椒、紅曲類(lèi)產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定。

·         第二法（C??固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法） ：適用于大米、大麥、燕麥、小麥中桔青霉素的測(cè)定。

三、第一法：免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

3.1 方法原理

試樣中的桔青霉素用甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，用桔青霉素免疫親和柱凈化。免疫親和柱內(nèi)鍵合有桔青霉素的特異性抗體，樣品通過(guò)時(shí)桔青霉素被抗體選擇性吸附，雜質(zhì)則隨淋洗液流出-。隨后用洗脫液使抗體變性，將桔青霉素從親和柱上洗脫下來(lái)。凈化后的樣品采用液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。

3.2 關(guān)鍵試劑與配制

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試劑的純度有明確要求：甲醇、乙腈、磷酸、冰乙酸均為色譜純。水為GB 6682規(guī)定的二級(jí)水。主要試劑配制包括：

·         磷酸溶液（10 mmol/L，pH 7.5） ：移取1.376 mL磷酸加水定容至2000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。

·         磷酸溶液（10 mmol/L，pH 2.5） ：同樣配制后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至2.5。

·         PBS緩沖溶液（pH 7.0） ：稱(chēng)取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀，用水溶解定容至1000 mL。

·         0.1%吐溫20-PBS溶液：移取1 mL吐溫20以PBS緩沖溶液定容至1000 mL。

·         洗脫液I：甲醇-10 mmol/L磷酸溶液（pH 2.5）（70+30）。

·         洗脫液Ⅱ：甲醇-0.1%磷酸溶液（70+30）。

標(biāo)準(zhǔn)品桔青霉素（C??H??O?，CAS號(hào)：518-75-2）純度要求≥99.0%。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100 μg/mL，于4℃下保存。

3.3 樣品前處理

大米、玉米、辣椒：稱(chēng)取粉碎試樣10.0 g，加入50 mL甲醇-水（70+30）提取液，高速均質(zhì)提取2 min。取1.0 mL濾液，加入49 mL 10 mmol/L磷酸溶液（pH 7.5）稀釋?zhuān)ＡЮw維濾紙過(guò)濾后待凈化。

紅曲及其制品：稱(chēng)取試樣1.0 g，加入20 mL甲醇-水（70+30）提取液，高速均質(zhì)提取2 min。取1.0 mL濾液，加入39 mL PBS緩沖溶液稀釋。

3.4 凈化

大米、玉米、辣椒：取10.0 mL稀釋濾液（相當(dāng)于0.04 g試樣）過(guò)桔青霉素免疫親和柱，流速1～2滴/秒。用5 mL 10 mmol/L磷酸（pH 7.5）淋洗后，用1.0 mL洗脫液I洗脫，收集洗脫液供檢測(cè)。

紅曲及其制品：取10.0 mL稀釋濾液過(guò)柱，用10 mL 0.1%吐溫20-PBS溶液淋洗后，用1.0 mL洗脫液Ⅱ洗脫。

3.5 液相色譜條件

大米、玉米、辣椒：C??色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量50 μL；激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm；流動(dòng)相A為乙腈，B為10 mmol/L磷酸（pH 2.5），采用梯度洗脫。

紅曲及其制品：C??色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)同上；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%磷酸，梯度洗脫。

3.6 定量與性能指標(biāo)

采用外標(biāo)法定量，配制0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL共6個(gè)濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

方法檢出限和定量限因基質(zhì)而異：大米、玉米、辣椒的檢出限為8 μg/kg，定量限為25 μg/kg；紅曲及其制品的檢出限為25 μg/kg，定量限為80 μg/kg。在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

四、第二法：C??固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法

4.1 方法原理

用乙腈-異丙醇-水的混合溶液提取試樣中的桔青霉素，經(jīng)C??固相萃取小柱凈化后，用配備熒光檢測(cè)器的液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。

4.2 關(guān)鍵試劑與前處理

提取溶劑為乙腈-異丙醇-水（35+10+55），用磷酸調(diào)pH至1.5。流動(dòng)相為乙腈-異丙醇-磷酸溶液（0.08 mol/L）（35+10+55）。

樣品經(jīng)粉碎過(guò)830 μm篩后，稱(chēng)取約5 g，加10 mL提取溶劑振蕩提取30 min，3500 r/min離心4 min。殘?jiān)性偌?/span>5 mL提取溶劑重復(fù)提取，合并上清液，加水至40 mL并用磷酸調(diào)pH至1.5。

4.3 凈化與測(cè)定

提取液過(guò)預(yù)淋洗好的C??固相萃取柱，用5 mL水淋洗，減壓抽干3 min后，用10 mL甲醇以1.0 mL/min速度洗脫。洗脫液在40℃下氮吹至干，以1.0 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后供液相色譜測(cè)定。

色譜條件：C??柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫28℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量50 μL；激發(fā)波長(zhǎng)331 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm。桔青霉素保留時(shí)間約為9.1 min。

4.4 性能指標(biāo)

第二法的檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，靈敏度優(yōu)于第一法。精密度要求與第一法相同。

五、兩法對(duì)比與選用建議

第一法采用免疫親和柱凈化，特異性強(qiáng)、凈化效果優(yōu)異，特別適合紅曲類(lèi)等基質(zhì)復(fù)雜的樣品。第二法采用C??固相萃取，操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本較低，靈敏度更高，適合谷物類(lèi)樣品的日常檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)樣品類(lèi)型和檢測(cè)需求選擇合適的方法。

六、結(jié)語(yǔ)

GB 5009.222-2016作為食品中桔青霉素檢測(cè)的強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，整合了原有的多項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，建立了以高效液相色譜-熒光檢測(cè)法為核心、兩種前處理方案并行的技術(shù)體系。該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施為監(jiān)管部門(mén)、食品生產(chǎn)企業(yè)及檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供了統(tǒng)一、規(guī)范的技術(shù)依據(jù)，對(duì)保障食品安全、控制紅曲類(lèi)產(chǎn)品及谷物中桔青霉素污染風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。